日前，國際頂級學術期刊《自然》在線發(fā)表了我國科學家題為《DNA單堿基編輯技術引起RNA（核糖核酸）脫靶及其通過突變消除RNA活性》的研究論文，首次證明了多個單堿基編輯技術均存在大量的RNA脫靶，并獲得3種更高精度的單堿基編輯工具，為單堿基編輯技術進入臨床治療提供了重要基礎——

時隔3個月，中國科學院腦科學與智能技術卓越創(chuàng)新中心楊輝研究組的成果再次登上了世界頂級學術期刊《自然》。這一次，這位“85后”研究員帶領著他的團隊，一路披荊斬棘，首次證明了多個單堿基編輯技術均存在大量的RNA脫靶，并獲得3種更高精度的單堿基編輯工具，為單堿基編輯技術進入臨床治療提供了重要基礎。

“這項研究提供了減少RNA脫靶的單堿基編輯器，對基因編輯領域具有重要價值。”國際同行如是評價。

神奇的單堿基編輯技術

隨著科學技術的不斷進步，基因編輯這一曾經(jīng)高高在上的科學名詞，如今已走進公眾視野。“基因編輯技術若使用得當，是能造福人類的。”楊輝舉例，利用這一技術，我們可以改良植物性狀，使得蔬菜保質(zhì)期更長、口感更好；而通過相關DNA復活滅絕物種等，都并非遙不可及。

當然，對于基因編輯技術來說，更關鍵的是可以治療一些惡性疾病。脊髓性肌營養(yǎng)不良、地中海貧血、血友病、視網(wǎng)膜黃斑變性、遺傳性耳聾……根據(jù)楊輝提供的數(shù)據(jù)，全球有3億罕見病患者，其中兒童占了一半。這7000多種罕見病絕大多數(shù)無有效藥物可治，猶如懸在頭頂上的一把達摩克利斯之劍，長久困擾著人類。

單堿基編輯技術的出現(xiàn)，猶如黎明前的一道曙光，讓科學家和患者們看到了希望。“80%的罕見病是單基因遺傳病。理論上，通過單堿基編輯技術可以修復50%以上的單基因遺傳病。”論文第一作者、中科院神經(jīng)所博士研究生周昌陽稱。

然而現(xiàn)實卻是，由于安全性一直無法確定，迄今為止，僅有兩三種基因編輯技術進入了臨床試驗階段。橫亙在罕見病患者面前的是一座看不見的高山。

基因是有遺傳效應的DNA片段。人類的DNA由31億多個堿基對組成，這些數(shù)量龐大的堿基對由ATCG四種堿基有機地排列組合而成。所謂基因編輯，即是對基因組中的特定DNA片段進行敲除、加入、替換等。2012年，憑借成本低廉、操作方便、效率高等優(yōu)勢，第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9迅速在科學界風靡。

在CRISPR/Cas9基礎上，隨后又衍生出了第四代基因編輯技術——單堿基編輯技術：一類是CBE，即可以將DNA四種核苷酸中的C突變成T或者G突變成A的一類編輯器；第二類是ABE，即可以將T突變成C或者A突變成G的編輯器。

“基因編輯工具CRISPR/Cas9相當于一個加了GPS的剪刀。”隨著研究深入，周昌陽等人發(fā)現(xiàn)，在針對很多疾病開展修復的過程中，由于CRISPR/Cas9首先需要切斷DNA雙鏈，再利用細胞自身的修復來精確修復，這往往導致切斷了DNA雙鏈之后，僅有一部分細胞會通過精確的同源重組來修復，另外一部分則會被隨機修復。而隨機修復往往會引起其他的突變，這就限制了CRISPR/Cas9技術在疾病治療中的應用。

“如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具用于臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌癥在內(nèi)的多種副作用。”楊輝說。

與CRISPR/Cas9相比，單堿基編輯技術可以更精細地修改DNA。“單堿基編輯技術在不需要切斷DNA雙鏈的情況下，就能精確實現(xiàn)DNA的定向突變，可以應用到大多數(shù)單基因遺傳病中。”周昌陽表示。

無處不在的脫靶風險

我們知道，在某些極端情況下，一個堿基的變化都可能導致某些基因功能的改變或者缺失，進而引發(fā)疾病。實際上，人類接近一半的單基因遺傳病，是由一個堿基變化導致。因而，能否把這個特定的堿基安全有效修復，這正是基因編輯工具肩負的一個重要使命。

“無論哪一種基因編輯工具，編輯效率和特異性一直是衡量其好壞的兩個關鍵因素。”周昌陽說，基因編輯技術的開發(fā)難點在于，既要能保證很高的目的位點編輯效率，又要能保證基因編輯工具的特異性。換句話說，我們的基因編輯工具只能編輯目的位點，不能編輯到其他不想編輯的位點。

理想很豐滿，現(xiàn)實很骨感。隨著研究的深入，自CRISPR/Cas9技術誕生以來，單堿基編輯這一被科學界寄予厚望的高精度基因編輯技術，也于今年初被證實難逃脫靶風險。

今年初，楊輝團隊建立起名為GOTI的新型脫靶檢測技術，通過精巧的實驗設計發(fā)現(xiàn)，原以為安全的CBE單堿基基因編輯技術存在DNA脫靶，其脫靶的概率相當于自然遺傳突變的20倍。這意味著什么？“如果脫靶發(fā)生到了癌基因和抑癌基因上，將會導致一定的致癌風險。”周昌陽解釋。而得益于這一發(fā)現(xiàn)，隨后有兩家公司正在推向臨床的兩個基因藥物項目及時叫停了。

探索的腳步?jīng)]有就此停止。此前，對于單堿基編輯技術脫靶問題的研究一直專注在DNA水平，該工具在RNA水平上是否也存在脫靶風險呢？瞄準新目標，楊輝團隊開始了新一輪的深入研究。

更安全精準的編輯工具

時光不負情深。此次，研究團隊將單堿基編輯技術脫靶檢測范圍擴展到了RNA水平，首次證明常用的3種單堿基編輯技術BE3、BE3-hA3A和ABE7.10均存在大量的RNA脫靶，并且發(fā)現(xiàn)ABE7.10高頻率地發(fā)生在癌基因和抑癌基因上，具有較強的致癌風險。

“在之前的研究報告中，CBE單堿基編輯技術存在全基因組范圍內(nèi)的DNA水平隨機脫靶，ABE單堿基編輯技術未檢測到DNA水平的脫靶。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，CBE和ABE均存在RNA水平的脫靶。”周昌陽告訴記者，這提示了該領域不僅需要關心基因編輯工具的DNA水平脫靶檢查，還需要關心RNA水平的脫靶檢查。“我們的初衷都是希望能夠開發(fā)出高編輯效率、高特異性的基因編輯工具，應用到疾病的治療中去。”周昌陽說。

事實證明，RNA脫靶確實存在于單堿基編輯器上，但是具體由哪一個部分引起的RNA脫靶呢？

研究團隊通過精巧的實驗設計，發(fā)現(xiàn)存在于單堿基編輯器中的脫氨酶是“罪魁禍首”。他們分別對CBE單堿基基因編輯技術的胞嘧啶脫氨酶，以及ABE單堿基基因編輯技術的腺嘌呤脫氨酶實施了突變優(yōu)化，將兩種脫氨酶的RNA結合活性失活掉，使其不能結合到RNA上，最終獲得能夠完全消除RNA脫靶，并維持DNA編輯活性的高保真單堿基編輯工具。

不僅如此，研究團隊開發(fā)的新一代ABE單堿基編輯工具還能夠縮小編輯窗口，實現(xiàn)更加精準的DNA編輯。該技術在特異性和精確性上超越了單堿基編輯器ABE7.10，有望在未來成為一種更加安全、更加精準的基因編輯工具，應用于臨床治療中。

周昌陽告訴記者，下一步，研究團隊將努力開發(fā)出既沒有DNA也沒有RNA脫靶的編輯工具。而如何使得基因編輯工具變得更小，更加方便導入到病人的細胞中開展治療，也是未來研究的一個重要方向。眼下，研究團隊已開始嘗試以小鼠和猴為模型，用基因編輯研究治療罕見病。